多发性骨髓瘤实验室检查特点

作者：医院汪薇

多发性骨髓瘤(multiplemyeloma,MM)是一种浆细胞单克隆恶性增生性疾病[1],其特征为由晚期B细胞分化的肿瘤性浆细胞分泌单克隆免疫球蛋白或重链,并伴有溶骨性病变和/或骨质疏松[2]。经统计,在所有恶性肿瘤中MM的发病率占到约1%,而在血液系统恶性肿瘤中其发病率超过10%[3]。其发病机制尚不完全清楚,临床症状多样,可以导致许多器官发生病理性改变。同时实验室检查指标差别也较大,导致MM的诊断和鉴别诊断困难。因此,探讨MM的临床、实验室诊断特点对MM的早期发现、早期诊断和早期治疗具有很大的临床意义。

自年开始,国内外就相继颁布了对多发性骨髓瘤的诊断标准,根据国际骨髓瘤工作组(theInternationalMyelomaWorkingGroup,IMWG)于年颁布的骨髓瘤及其相关疾病的简化分类标准,中华医学会中国医师协会血液科医师分会召集全国部分专家于年制定了《年中国多发性骨髓瘤诊治指南》。

一、诊断标准

1.世界卫生组织年MM的诊断标准[4](1)主要诊断指标:骨髓中浆细胞15%,并有异常浆细胞(骨髓瘤细胞)或组织活检证实为浆细胞瘤;血清中出现大量单克隆球蛋白(M蛋白),IgG35g/L,IgA20g/L,IgD2.0g/L,IgE2.0g/L,IgM15g/L或尿中单克隆免疫球蛋白轻链(Bence-Joneprotein,B-J蛋白)1.0g/24h,少数病例可出现双克隆或三克隆。(2)次要诊断指标:骨髓中浆细胞增多10%~30%;M成分存在,但水平低于诊断指标;有溶骨性病变;正常免疫球蛋白减少,IgG6g/L,IgA1g/L,IgM0.5g/L。MM的诊断需具备上述1项主要指标和1项次要指标,或具备上述3项次要指标,并且患者应具有MM相关的临床表现。(3)分型:依照增多的异常免疫球蛋白类型可分为以下8型:IgG型、IgA型、IgD型、IgM型、IgE型、轻链型、双克隆型及不分泌型。

二、实验室常规检查项目

1.血常规大多数MM患者血红蛋白(hemoglobin,Hb)含量和红细胞(redbloodcell,RBC)计数会有一定范围的降低,大多数患者表现为正细胞正色素性贫血,也有小部分出现小细胞低色素性贫血症状,贫血程度会随着病情的进展逐渐加重[5]。白细胞计数多正常,但也可增高或降低。血小板计数早期正常或增高,病情进展时可减少。

外周血涂片成熟RBC的形态大致正常,常见RBC重叠排列呈缗线状,这是由于异常增高的免疫球蛋白附着在RBC表面的缘故。免疫球蛋白所带的是正电荷,而RBC表面唾液酸所带的是负电荷,两者相互抵消,使RBC之间的排斥力减弱,易于聚集[6]。

MM患者骨髓瘤细胞的浸润和增生使骨髓基质受损,造血微环境损伤,红系造血组织受抑,从而抑制骨髓的正常造血,导致患者贫血的发生。还有部分患者由于肾功能的损害导致促RBC生成素生成减低引起RBC生成减少[7]。有研究表明,当MM患者的Hb检测结果85g/L时,化疗效果变差,而其生存期也受到直接影响[8]。因此Hb是MM重要的预后因素之一,在一定程度上它反映了肿瘤负荷。

2.白蛋白/球蛋白比值(A/G)在疾病初期,大部分MM患者的球蛋白增高,直接导致总蛋白明显增加,白蛋白水平正常或降低。随着病情的进展,肝细胞合成功能降低导致白蛋白生成降低,且MM患者蛋白丢失增加,摄入减少,也会使白蛋白降低,导致A/G倒置。血清白蛋白作为MM的独立预后因素,在许多临床研究中得以证实,其与肿瘤负荷和宿主体能主要相关[9]。JACOBSON等[10]研究认为MM患者体内肝细胞合成白蛋白会受到高白细胞介素6(interleukin6,IL-6)水平抑制,且与毛细血管通透性增加等因素有一定相关性。该研究证实了白蛋白水平与IL-6水平呈负相关,而白蛋白降低则提示患者疾病预后不良。

3.肾功能检测MM患者肾脏损害的发生由多种因素导致,其中骨髓瘤细胞所分泌的单克隆免疫球蛋白轻链在肾脏的沉积是导致MM肾病的主要原因[11]。实验室检查特征表现为血尿素氮及肌酐水平增高、肌酐清除率降低等,晚期甚至可出现尿毒症。严重的肾损害直接导致MM患者预后不良,而且是MM患者早期死亡的重要原因之一[12]。RESIC等[13]的研究显示轻链型MM患者比其它类型的MM患者更容易发展为肾功能不全。

4.免疫球蛋白检测根据上述的诊断标准,IgG型MM患者64%~80%出现IgG含量增高而IgA和IgM含量降低,IgA型MM患者只有58%出现IgA含量增高,IgG和IgM含量减低的占75%~%;%IgM型MM患者的IgM含量都增高,其它2种免疫球蛋白降低的占61%~75%;71%~%的轻链型MM患者IgA、IgG、IgM含量都部分降低。在对MM的免疫球蛋白含量的检测中,IgG型和IgM型阳性率最高,IgA型次之,而轻链型由于其免疫球蛋白含量增高不明显,导致阳性率不高[14]。免疫球蛋白定量检测不能提示单克隆免疫球蛋白的存在,但当某种类型免疫球蛋白含量极度增高的同时,其它类型免疫球蛋白含量极度减低,应高度怀疑MM[15]。

5.β2微球蛋白(beta2microglobulin,β2-MG)β2-MG是由99个氨基酸组成的相对分子质量为10的单链多肽,作为有核细胞膜表面人类白细胞Ⅰ类抗原(humanleukocyteantigenⅠ,HLA-Ⅰ)分子的一部分,也可由浆细胞表面脱落到血清,其血清学水平可以间接反映MM的肿瘤负荷[16]。β2-MG广泛存在于血浆、尿液、脑脊液及初乳中。正常人血中β2-MG浓度极低,可自由通过肾小球,并在近端小管内几乎全部重吸收。因此β2-MG水平升高常提示肿瘤细胞生长过快、疾病进展,是一项独立的预后指标[17]。有研究显示,血清β2-MG5.5mg/L的MM患者中位生存期为29个月[18]。医院血液科分析了78例MM患者的预后因素,结果显示,在单因素分析中,年龄≥65岁、血清肌酐≥μmol/L以及β2-MG≥3.5mg/L是危险因素[19]。

6.血清游离轻链完整的免疫球蛋白是由2条重链、2条轻链通过二硫键连接而构成。在B淋巴细胞中,按一定比例进行合成并装配成为正常人的免疫球蛋白。在一般情况下轻链的合成速度略快于重链,所以会出现一些富余的轻链。正常个体每日产生约mg轻链,除与重链组成完整的免疫球蛋白分子外,近40%的富余轻链呈游离状态[20]。肾脏是血清游离轻链的主要代谢器官,分子大小影响清除速率。由于轻链的相对分子质量小,正常人体内每天产生的轻链可自由通过肾小球的滤过屏障,而几乎全部被重吸收在近曲小管,终尿中的轻链只有1~10mg。肾功能正常者,当血清中轻链的含量超过近曲小管的最大重吸收能力时才可能在尿中溢出。如轻链的量远大于肾脏的重吸收能力,进入远曲小管后可导致肾小管堵塞,肾功能不全。此时血清轻链水平更高,而尿轻链减少,进一步加重残存肾单位的负担,最终导致肾功能衰竭。因此,与尿轻链相比,血清游离轻链的水平能更真实地反映病情的发展[21]。IWMG指南中已将血清游离轻链作为浆细胞疾病包括MM的诊断、监测和预后的重要指标[22]。

三、血、尿M蛋白鉴定

年WALDENSTROM[23]首先提出了多克隆γ球蛋白血和单克隆γ球蛋白血的概念;年GUTMAN首先使用M蛋白这一术语,现在文献也多采用这一名词,因为M是单克隆(monoclonal)、骨髓瘤(myeloma)、巨球蛋白血症(macroglobulinemia)的共有字头。MM的特征性表现就是M蛋白的出现[24]。97%的MM患者能够通过血、尿样本的蛋白电泳和免疫固定电泳(immunofixationelectrophoresis,IFE)发现完整的免疫球蛋白或单一游离轻链。80%的MM患者血清蛋白电泳(serumproteinelectrophoresis,SPE)中能出现单一峰值或条带,病情好转的大多数MM患者存在低γ球蛋白血症[25]。

1.SPE检测SPE是一种即简单又廉价的筛选方法,推荐采用高分辨率琼脂糖凝胶电泳检测M蛋白。该法将血清蛋白分成5个区带:白蛋白、α1、α2、β和γ区带。白蛋白区的成分包括白蛋白、前白蛋白和部分α1脂蛋白;α1区包括α1抗胰酶蛋白、α1脂蛋白、GC球蛋白;α2区包括触珠蛋白、铜蓝蛋白、α2巨球蛋白等;β1区包括转铁蛋白、补体C3c、IgA、血凝素等;β2区包括C3b、IgA;γ区包括IgG、IgM、C反应蛋白(Creactiveprotein,CRP)等。由此可见各种免疫球蛋白多电泳至γ区,是γ区的主要组分,有时也出现在β-γ或β区,偶尔可在α2区。M蛋白在琼脂糖凝胶上呈现为致密、清晰的条带,在光密度扫描图上则显示为底窄峰尖的图形,随着现代化程度的发展,所得电泳结果透明度高,图谱清晰,分辨率高,重复性好,简便快速,价格低廉,是免疫增生性疾病较好的筛查实验[26]。但当M蛋白峰出现在β-γ、β区或α2区时,不易观察到是否有单克隆峰的存在,存在一定的漏诊率。轻链型、不分泌型或IgD型MM患者常伴有低丙种球蛋白血症,表现为γ成分减少(血清IgG6g/L),通过检测血清IgG、IgA和IgM水平可以明确。

2.IFE检测IFE是一种将琼脂糖凝胶电泳,蛋白质电泳和免疫沉淀原理相结合的免疫学分析方法,它同时具有蛋白质电泳的高分辨率和抗原抗体反应的特异性特点,具有高敏感性、高特异性等优点,对MM的临床诊断分型和分期都有重要意义[27]。有文献报道,在IgG型、IgA型、轻链型MM诊断中,IFE对单克隆免疫球蛋白的检出率比血清蛋白电泳有显著增加[28]。

进行IFE时,待检血清至少分为6份样本同时进行电泳,一是作为参考,其它5份电泳后加不同的特异性抗体(抗γ、抗μ、抗α、抗κ及抗λ抗体,如疑为IgD或IgE类型则用抗δ或抗ε抗体)进行抗原抗体反应,以形成沉淀复合物,洗去非结合蛋白并染色显示条带。进行IFE时,也可先用抗κ或抗λ抗血清筛选,如果发现阳性结果,则选用γ、μ和α抗体进一步检测。如临床高度怀疑M蛋白病,但上述抗重链抗体均无阳性条带,务必用抗δ或抗ε抗体再次进行检测。进行IFE时,抗原抗体的比例也要适当,如果抗原浓度过高,免疫沉淀复合物中央区会发生溶解,导致空心现象,干扰结果判断。

3.尿M蛋白检测尿M蛋白是骨髓瘤细胞过度合成和分泌的游离单克隆轻链。在疾病初期,血清中的这些自由轻链可以通过肾小球滤出而被清除,而在肾小管中自由轻链被分解代谢,因此尿蛋白检测为阴性,但轻链型、IgD型MM患者因肾功能易受损害,尿蛋白出现阳性结果可以是首发甚至唯一的临床表现。单纯蛋白尿多见,也可表现为蛋白尿、尿白细胞增多,上述病例也可合并血尿,易误诊为肾小球肾炎、肾病综合征等。晚期可出现肾功能不全。

四、MM骨髓细胞学检查

骨髓细胞学是诊断MM的重要手段,骨髓瘤细胞或异常浆细胞通常占10%~90%以上。骨髓有核细胞多表现为增生活跃或增生明显活跃,少见增生减低、增生极度减低及增生极度活跃。

年欧洲血液学会根据细胞分化程度及形态特点将骨髓瘤细胞分为4型:Ⅰ型,成熟浆细胞型;Ⅱ型,幼浆细胞型;Ⅲ型,原浆细胞型;Ⅳ型,网状细胞型。国内标准分为2型:Ⅰ型,(1)原浆细胞型,(2)幼浆细胞型,(3)中间或过渡型;Ⅱ型,(1)幼浆细胞型,(2)成熟浆细胞型,(3)网状细胞型,(4)火焰细胞型。

MM患者骨髓象中浆细胞数量和形态的改变最具特征性。当骨髓浆细胞比例10%时,对诊断尤为重要的是细胞形态学的检查中有无细胞畸形[29]。在MM中较为常见的是浆细胞的双核或多核,偶尔表现为细胞核呈哑铃型或花瓣形。异型浆细胞常可见成堆分布的现象,且形态往往大小不一。有病例可见到分布较多的退化型浆细胞,可作为骨髓片现象的描述而不列入细胞的计数。有时可见核畸形,胞质丰富,呈深蓝色,不透明,可见空泡与少量嗜苯胺蓝颗粒[30]。有些浆细胞内可见嗜酸性拉塞尔小体(Rusellbody)(拉塞尔小体是指胞质中出现嗜酸性葡萄状空泡样包涵体,包含免疫球蛋白)或浆内有较多大小不等的空泡(Mott细胞),有时还可见3个核或多核浆细胞等异常改变。由于MM骨髓浆细胞除弥散性浸润外还可呈灶性分布,同一患者不同时期、不同部位的骨髓浆细胞数量可以相差明显,故有时需多部位穿刺。浆细胞形态的明显异常表现为火焰状浆细胞、葡萄状浆细胞或桑葚状浆细胞等[31]。ISHIKAWA等[32]研究发现浆细胞形态幼稚、数量增多提示MM病情严重,预后不良。

2.骨髓病理组织学检查MM患者的组织病理学主要表现为骨髓瘤细胞的组织器官浸润和单克隆免疫球蛋白或其片段沉积引起的组织损害。由于骨髓瘤细胞可呈灶性分布,原始、幼稚型浆细胞与基质的黏附过强,可能导致涂片时瘤细胞比例被低估。因此,骨髓活检能更早、更准确地显示瘤细胞的分布及细胞类型,骨髓活检组织不仅可观察造血组织的改变,还可同时观察基质和骨的改变。

五、浆细胞免疫学检查

随着对MM认识的逐渐深入,人们越来越重视骨髓瘤细胞免疫表型的相关特征及其对MM的诊断、治疗和预后等临床意义。在临床上,通过检测细胞表面所表达抗原的强弱、异常抗原的出现,包括有无细胞内免疫球蛋白的轻链限制性,可以把骨髓瘤细胞和正常浆细胞区别开来。正常浆细胞表面强表达CD38和CD27,表达CD,且无轻链限制性,与正常成熟B细胞相比,CD45和CD19的表达较弱,不表达CD56、CD、CD28,同时不表达B系抗原如CD20、CD22。典型的骨髓瘤细胞免疫分型特点为:异常表达CD28、CD、CD20、CD56、CD13、CD33、CD27和弱表达CD38,不表达CD19和CD45,并且有轻链限制性。

浆细胞免疫标记对反应性浆细胞增多症与克隆性浆细胞增生的鉴别有一定价值,并可用于微小残留病灶的检测。但在鉴别良、恶性浆细胞病时,应同时结合其它指标,如浆细胞形态学、M蛋白鉴定等。

六、细胞遗传学检查

MM患者中的单克隆浆细胞内存在多种复杂的异常染色体。有研究表明,骨髓瘤浆细胞上表达的CD45与临床分期相关[33]。CD45阳性患者的14q32染色体易位发生率较低,该染色体异常是MM复发和预后的重要因素[34]。13号染色体部分或完全缺失是MM常见的染色体异常,是预后及生存期预测的重要指标之一。存在1q21染色体扩增的患者预后较差,生存期较短,易复发[35]。患者染色体17p13缺失,会使病情进展加快、对治疗反应差、生存期缩短,同时会导致较高概率的髓外病变、高钙血症及浆细胞瘤,该研究认为17p13缺失是MM的高危因素之一[36]。

七、MM骨病标志物

高达90%的MM在初诊时或在病程中出现骨质破坏,其本质为溶骨性病变,大多难以痊愈,表现为骨痛、溶骨性病变、弥漫性骨质疏松[37]。60%以上的患者发生病理性骨折。由于MM患者的破骨细胞活性增强而成骨细胞活性相对受抑,导致骨质吸收、破坏增强而成骨、骨的重塑减少,因此临床上除影像学检查外,反映骨质破坏的标志物也可用于MM骨病检测[38]。

近年来,关于细胞遗传学异常的相关研究以及对骨髓微环境越来越深的理解,均为MM的发病机制提供更多的依据;也为新的联合治疗方案和新药研发奠定了基础[39]。同时实验技术的进步使得临床的诊断得到不断提高。

参考文献（略）

来源：《检验医学》杂志

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