竺晓凡团队单细胞测序开启骨髓衰竭性疾病研

编者按

骨髓衰竭性疾病患者细胞量少的问题是影响临床进行基础研究的障碍之一，单细胞测序技术的出现，可以很好的解决此问题。面对这一严重威胁儿童生命健康的血液系统疾病，中国医院（血液学研究所）竺晓凡教授团队受邀，就单细胞测序技术在血细胞生理发育、移植后生物行为及再生障碍性贫血发病机制、临床治疗及预后研究中的新发现撰文进行阐述。

骨髓衰竭性疾病是严重威胁儿童生命健康的血液系统疾病之一，包括先天性骨髓衰竭性疾病（IBMFS）与获得性骨髓衰竭性疾病两大类，在过去的临床实践中，两大类疾病的区分是临床治疗的重要基础，二代测序的发展为临床靶向测序提供了条件，现在已广泛应用于临床，既减少了先天性骨髓衰竭的漏诊率，也让我们发现了新的疾病预后因素，但随着临床应用我们也发现了一些新的问题：如靶向测序中未发现与临床相关的突变基因；临床诊断IBMFS,但经过全面测序后仅发现相关疾病的杂合突变；临床不能确诊IBMFS，但发现了IBMFS基因的杂合突变；同时发现多种IBMFS疾病的突变，但与临床表现不符[1]。

在这些问题中，除了未知突变、大片段缺失等情况，还应想到嵌合状态的存在，目前对于嵌合状态的检测方法莫过于单细胞测序（single-cellsequencing,SCS）的方法。同时，骨髓衰竭性疾病发生发展过程中的病理生理机制在单细胞测序方法应用下也有了新的进展。

单细胞测序是一种在单个细胞水平上进行的高通量测序技术，可以通过观察单个细胞的基因组、转录组信息获得细胞在病态和正常状态下的差异，对疾病发生发展及治疗转归进行监测。在血液系统中，单细胞测序已在血细胞生理发育、移植后生物行为及再生障碍性贫血发病机制、临床治疗及预后研究中显出优势。

单细胞在血细胞生理发育中的应用与结果

中国医院（血液学研究所）程涛教授联合多个课题组利用单细胞转录组测序方法，从21例健康成人的骨髓以及外周血中分选了32种血细胞（包括CD34+造血干细胞、B淋巴细胞、NK细胞、T细胞、单核细胞、中性粒细胞及红系细胞等），共收集了个单细胞，每个细胞检测了约个蛋白编码基因和1,左右的长非编码RNA（lncRNAs），结果显示：与B细胞、单核细胞和红细胞相比，NK细胞、T细胞和中性粒细胞在从祖细胞到分化阶段细胞间缺乏连续的转录过渡阶段，说明这些细胞在成熟过程中基因表达发生了巨大变化，或者存在一类在已知细胞表面标记下不能被捕获的过渡细胞群体（图1A）。结果显示AVP在HSCs和MPPs特异性表达，CD79B，GZMH和CCR7分别在B细胞、NK细胞和T细胞特异性高表达，而SPI1和GATA1在中性粒细胞/单核细胞和红系细胞高表达（图1B）。文中首次提出CD74阳性的有核红细胞可能具有免疫功能。此项结果首次构建了人各类血细胞的精细转录组图谱和转录因子调控图谱。该图谱全面整合了血细胞的转录组信息和免疫表型信息，为后续的血液生理学和病理学研究提供了重要的血细胞注释依据和参考价值[2]。

图1：A不同细胞系基因连续表达概况；B不同细胞的基因表达情况

单细胞在小鼠移植后的生物行为研究

程涛教授亦联合多个课题组借助单细胞转录组深度测序技术建立了小鼠稳态造血情况下造血细胞群的单细胞转录组图谱（来自骨髓和脾脏的共28个免疫表型血细胞群）并进一步利用该图谱和小鼠造血干细胞（Haematopoieticstemcell,HSC）移植模型追踪移植后早期（1周内）HSC的生物学行为变化，发现移植后早期供体HSC快速向不同潜能的MPP细胞进行分化，同时伴有少量巨核/红系和髓系前体细胞(tMEs和tGMs)的出现；供体来源细胞中残存的HSC主要为tHSC1和tHSC2：tHSC1在移植后与稳态下相比表现为细胞周期更加静息，向不同谱系分化潜能下降，而tHSC2在移植后细胞周期比稳态下更加活跃，向髓系、巨核红系的分化潜能增强；HSC频率在移植后1周内逐渐下降，但少量残存的HSC仍然具有长期维持造血重建的能力；HSC移植后早期分化的MPP和少量tMEs和tGMs数量呈现动态变化过程，伴随有免疫反应、不同谱系特异性转录因子和标志基因的波动性基因表达趋势；研究还提出微环境中关键造血因子EPO和G-CSF浓度的显著上升可能触发了细胞向红系和巨核系的快速分化[3]。

单细胞在再生障碍性贫血中的研究

在年，中国医院（血液学研究所）朱才英[4]等还利用单细胞转录组测序技术从异质性角度解析了再障全谱系血细胞减少的分子基础，结果提示再障患者存在谱系选择性造血损伤；异常可变剪切介导的DNA损伤修复信号的改变可能是再障恶性转化为骨髓增生异常综合征（MDS）的关键因素之一；通过细胞表面受体和配体的基因表达分析，发现再障中T淋巴细胞和HSPC相互作用显著增强，而诱导凋亡的相互作用分子对如FAS/FASL、TNF/TNFR等相互作用普遍存在于重型再障骨髓细胞中。研究还发现诱导单核/巨噬细胞炎症反应的CCL5/CCR5分子对在单核/巨噬细胞前体细胞（MD1/MD2）与CD4+/CD8+T效应细胞相互作用中显著增强，提示单核/巨噬细胞的异常免疫反应对再障疾病进展可能具有调控作用。研究还发现免疫抑制治疗缓解患者的造血系统中，HSPC和T淋巴细胞的基因表达并没有完全恢复到正常水平，甚至接近治疗前的状态，这可能是再障患者需要长期维持免疫抑制治疗的主要原因之一。此项研究为再障患者免疫抑制干预提供了新思路和潜在的新靶点。

骨髓衰竭性疾病患者细胞量少的问题是影响我们进行基础研究的障碍之一，单细胞测序技术的出现，可以很好的解决此问题，同时骨髓衰竭疾病多克隆、多系细胞间的差异以及患者嵌合状态的问题在单细胞测序的方法下均可得到一定的解决。虽然目前单细胞测序存在价格昂贵、测序后分析方法需要改进等问题[5]，相信随着测序技术的发展及生物信息技术的进步，单细胞测序将开启骨髓衰竭性疾病研究新篇章，会在儿童骨髓衰竭性疾病的发病机制、临床转归及预后分析研究中大放异彩。

参考文献：

[1]竺晓凡.二代测序技术在先天性骨髓衰竭综合征诊断中的合理应用与结果分析.临床血液学杂志.,33(11):-

[2]XieX,LiuM,ZhangY,etal.Single-celltranscriptomiclandscapeofhumanbloodcells.NationalScienceReview.-08-24.

[3]DongF,HaoS,ZhangS,etal.Differentiationoftransplantedhaematopoieticstemcellstrackedbysingle-celltranscriptomicanalysis.NatCellBiol.Jun;22(6):-.

[4]ZhuC,LianY,WangC,etal.Single-celltranscriptomicsdissectshematopoieticcelldestructionandTcellengagementinaplasticanemia.Blood.Mar24.

[5]ZhuC,PreisslS,RenB.Single-cellmultimodalomics:thepowerofmany.NatMethods.Jan;17(1):11-14.

本文作者

主任医师，博士生导师

竺晓凡

中国医院（血液学研究所）儿童血液病诊疗中心主任

中国抗癌协会小儿血液肿瘤专业委员会副主委。天津市医学会儿科分会血液学组主委、天津市小儿肿瘤专业委员会副主委。《中华儿科杂志》、《中华血液学杂志》、《中国当代儿科杂志》、《中国实用儿科杂志》、《国际儿科学杂志》等杂志编委。

承担国家级及省部级课题多项。荣获天津市自然科学一等奖、天津市科技进步三等奖、五洲女子科技奖、宋庆龄儿科医学奖等奖项。发表论文百余篇，近五年以第一作者、通讯作者在《NatureGenetics》《JAMAOncology》《NucleicAcidsResearch》《Blood》《BMCMedGenomics》及《ExperimentalHematology》等发表论文多篇。

博士，副主任医师

常丽贤

中国医院（血液学研究所）副主任医师

中国生物工程学会干细胞工程技术分会会员，天津市罕见病协会青年委员。

致力于儿童骨髓衰竭性疾病的临床诊疗及基础研究工作，目前承担并完成国家自然科学基金青年项目1项、中国医学科学院院级课题分课题1项；主要参与国家自然科学基金面上项目2项、国家重点研发计划1项。以第一作者发表国内核心期刊及SCI论文15余篇。

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